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实验室新手指南之质粒的提取

发布时间:2018-05-09 16:07:35 阅读: 来源:启闭机厂家
实验室新手指南之质粒的提取 碱裂解法提取质粒 DNA 操作步骤1、挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落,接种于 20ml LB(含Amp100ug/ml)液体培养基中,37℃、250rmp 振荡培养过夜(约12⑴4hr)。2、取 1.5ml 培养液倒入 1沧州二手工作服
.5ml eppendorf 管中,12000rmp 离心1⑵min螺蛳湾工作服批发
。弃上清,将离心管颠倒于卫生纸上,使液体尽量流尽。3、菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡,使菌体分散混匀。),室温下放置 5⑴0 min。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,非金属材料拉力试验台
盖紧管口,快速温和颠倒 eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 min,使细胞膜

碱裂解法提取质粒 DNA 操作步骤

1、挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落,接种于 20ml LB(含

Amp100ug/ml)液体培养基中,37℃、250rmp 振荡培养过夜(约

12⑴4hr)。

2、取 1.5ml 培养液倒入 1.5ml eppendorf 管中,12000rmp 离心1⑵min。弃上清,将离心管颠倒于卫生纸上,气瓶外测法水压检测仪
使液体尽量流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于 100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡,使菌体分散混匀。),室温下放置 5⑴0 min。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl,盖紧管口,快速温和颠倒 eppendorf管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),拉链往复寿命检测台
冰浴5 min,使细胞膜裂解(溶液Ⅱ为裂解液,故离心管中菌液逐步变清)。

5、加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,将管温和颠倒数次混匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置 5min。 12000rmp 离心 10min。溶液Ⅲ为中和溶液,此时质粒 DNA 复性,染色体和蛋白质不可逆变性,构成不可溶复合物,同时 K+使 SDS-蛋白复合物沉淀。

6、上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯fang/异戊醇,振荡混匀, 12000rmp 离心 10min。(450μl 的苯酚/氯fang/异戊醇)

7、谨慎移出上清于1新微量离心管中,加入 2 倍体积预冷的无水乙醇,混匀,室温放置 2⑸min,离心 12000rmp×10min。qbg100高频疲劳检测仪

8、弃上清,将管口敞开颠倒于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70%乙醇洗沉淀1次,12000rmp 离心 5 min。

9、吸除上清液,将管颠倒于卫生纸上使液体流尽,室温干燥。

10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0,含20μg /ml RnaseA,约4μl) 中,37℃水浴 30min 以降解 RNA 份子,数显材料扭转试验机
储于⑵0℃冰箱中。

实验试剂及配制

1、LB 液体培养基

称取蛋白胨(Tryptone)10 g,酵母提取物(Yeast extract) 5g, NaCl 10g,溶于 800ml 蒸馏水中,用 NaOH 调 pH 至 7.5,加水至整体积 1 升,高压下蒸气灭菌 15 分钟。

2、氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液:配成 100mg/ml 水溶液, ⑵0℃保存备用。深度磨损试验机

3、溶液Ⅰ50mM 葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8外出可以穿工作服吗
.0)。

配制方法:1M Tris-HCl(pH 8.0)12.5ml,0.5M EDTA(pH 8.0)10ml,葡萄糖 4.730g合肥西餐厅员工工作服
,加 ddH2O 至 500ml。在 121℃高压灭菌 15min ,储存于 4℃。

4、溶液Ⅱ0.2M NaOH,色牢度检测仪
1% SDS

配制方法:2M NaOH 1ml,10%SDS 1ml,加 ddH2O 至 10ml。使用前临时配置。

5、溶液Ⅲ:醋酸钾(KAc)缓冲液,pH 4.湿砂橡胶轮式磨损试验机
8

配制方法:5M KAc 300ml,冰醋酸 57.5ml,加 ddH2O 至 500ml。4℃保存备用。

苯酚/氯fang/异戊醇(25:24:1)

氯fang可以使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇则可起消除抽提进程中出现的泡沫。酚和氯fang均有很强的腐蚀性,操作时应戴手套。

无水乙醇

70%乙醇

TE:

10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0)。1M Tris-HCl(pH 8.0)1ml , 0.5M EDTA(pH8.0)0.2ml,加 ddH2O 至 100ml。121℃高压湿热灭菌 20min,4℃保存备用西藏定做工服厂家

1M Tris-HCl(Tris(3羟甲基)氨基甲烷):800ml H2O 中溶解 121g Tris 碱,用浓盐酸调 pH 值,混匀后加水到 1L。

0.5M EDTA(乙2胺4乙酸):700mlH2O 中溶解 186.1g Na2EDTA.高低温等速伸长检测仪
2H2O,用 10M NaOH 调 pH8.0(需约 50ml),补 H2O 到 1L。

6、RNA 酶 A 母液:

将 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L TrisC· l(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成 10mg/ml 的溶液,于 100℃加热 15 分钟,使混有的 DNA 酶失活。冷却后用 1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于⑵0℃。

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